Food Safety | Dr. Nodali Ndraha

Panduan dan Tabel Referensi Lengkap MPN 3-Tabung

Wed, 27 May 2026 10:00:00 +0700

Dokumen ini merupakan panduan referensi laboratorium untuk membaca, menginterpretasikan, dan menghitung estimasi kepadatan populasi mikrob menggunakan metode statistik Most Probable Number (MPN) dengan seri 3-tabung. Tabel dan aturan pembacaan di bawah ini merujuk pada standar baku U.S. Food and Drug Administration – Bacteriological Analytical Manual (FDA BAM Appendix 2).

Note

Kapan menggunakan MPN? Metode MPN sangat ideal untuk mengestimasi konsentrasi bakteri target yang rendah ($< 10\text{--}100\text{ CFU/g}$), sampel dengan matriks partikulat yang mengganggu perhitungan koloni pada cawan (pour/spread plate), atau ketika memerlukan tahap pemerkayaan (enrichment) selektif.

1. Prinsip Dasar

Tabel standar MPN 3-tabung didasarkan pada inokulasi sampel menggunakan 3 tingkat pengenceran desimal berturut-turut (faktor pengenceran kelipatan 10).

Volume atau bobot ekuivalen sampel asli (inoculum) yang menjadi dasar perhitungan tabel standar ini adalah:

Tabung Seri 1: $0.1\text{ g}$ atau $\text{mL}$ (setara dengan $1\text{ mL}$ dari pengenceran $10^{-1}$)
Tabung Seri 2: $0.01\text{ g}$ atau $\text{mL}$ (setara dengan $1\text{ mL}$ dari pengenceran $10^{-2}$)
Tabung Seri 3: $0.001\text{ g}$ atau $\text{mL}$ (setara dengan $1\text{ mL}$ dari pengenceran $10^{-3}$)

2. Tabel Referensi MPN 3-Tabung (Inokulum 0.1, 0.01, dan 0.001 g/mL)

Nilai pada tabel berikut merupakan Indeks MPN per gram atau per mL sampel asli beserta interval kepercayaan 95% (95% Confidence Interval), dengan asumsi seri pengenceran yang diinokulasikan adalah $10^{-1}$, $10^{-2}$, dan $10^{-3}$.

Kombinasi Positif ($10^{-1} : 10^{-2} : 10^{-3}$)	Indeks MPN (per g atau mL)	Batas Kepercayaan 95% (Bawah – Atas)
0 - 0 - 0	$< 0.3$	$0.00 - 0.95$
0 - 0 - 1	$0.3$	$0.01 - 1.7$
0 - 1 - 0	$0.3$	$0.01 - 1.7$
0 - 1 - 1	$0.6$	$0.05 - 2.5$
0 - 2 - 0	$0.6$	$0.05 - 2.5$
1 - 0 - 0	$0.4$	$0.02 - 1.7$
1 - 0 - 1	$0.7$	$0.07 - 2.4$
1 - 0 - 2	$1.1$	$0.10 - 4.4$
1 - 1 - 0	$0.7$	$0.07 - 2.5$
1 - 1 - 1	$1.1$	$0.15 - 4.5$
1 - 2 - 0	$1.1$	$0.15 - 4.5$
1 - 2 - 1	$1.5$	$0.30 - 5.5$
2 - 0 - 0	$0.9$	$0.15 - 3.5$
2 - 0 - 1	$1.4$	$0.30 - 5.5$
2 - 0 - 2	$2.0$	$0.40 - 7.5$
2 - 1 - 0	$1.5$	$0.30 - 6.5$
2 - 1 - 1	$2.0$	$0.40 - 7.6$
2 - 1 - 2	$2.7$	$0.70 - 8.5$
2 - 2 - 0	$2.1$	$0.40 - 7.6$
2 - 2 - 1	$2.8$	$0.80 - 9.4$
2 - 2 - 2	$3.5$	$1.00 - 13.0$
2 - 3 - 0	$2.9$	$0.90 - 9.4$
2 - 3 - 1	$3.6$	$1.00 - 13.0$
3 - 0 - 0	$2.3$	$0.46 - 9.4$
3 - 0 - 1	$3.8$	$0.80 - 13.0$
3 - 0 - 2	$6.4$	$1.60 - 20.0$
3 - 1 - 0	$4.3$	$0.90 - 18.1$
3 - 1 - 1	$7.5$	$1.70 - 20.0$
3 - 1 - 2	$12.0$	$3.00 - 29.0$
3 - 1 - 3	$16.0$	$3.00 - 38.0$
3 - 2 - 0	$9.3$	$1.80 - 36.0$
3 - 2 - 1	$15.0$	$3.00 - 48.0$
3 - 2 - 2	$21.0$	$5.00 - 63.0$
3 - 2 - 3	$29.0$	$8.00 - 89.0$
3 - 3 - 0	$24.0$	$4.00 - 99.0$
3 - 3 - 1	$46.0$	$9.00 - 198.0$
3 - 3 - 2	$110.0$	$30.0 - 380.0$
3 - 3 - 3	$> 110.0$	—

3. Panduan Pemilihan Seri Pengenceran

Dalam pengujian rutin, kita sering menginokulasi lebih dari 3 tingkat pengenceran (misalnya 5 seri dari $10^{-1}$ hingga $10^{-5}$) agar rentang populasi bakteri yang tinggi tetap terukur. Untuk membaca tabel MPN, Anda harus memilih 3 tingkat pengenceran berurutan guna membentuk kode 3 digit.

Aturan Penentuan 3 Digit MPN:

Aturan 1 (Standar): Pilih pengenceran tertinggi (paling encer) yang seluruh tabungnya positif (bernilai 3), diikuti dua tingkat pengenceran berikutnya.
- Hasil pengamatan ($10^{-1}$ s.d. $10^{-5}$): 3 - 3 - 2 - 1 - 0
- Cara memilih: Ambil angka 3 yang paling kanan (pada $10^{-2}$) beserta dua pengenceran setelahnya ($10^{-3}$ dan $10^{-4}$).
- Kombinasi terpilih: 3 - 2 - 1 (mewakili seri $10^{-2}, 10^{-3}, 10^{-4}$).
Aturan 2 (Semua $< 3$): Jika tidak ada pengenceran yang seluruh tabungnya positif, pilih 3 pengenceran terendah (paling pekat).
- Hasil pengamatan ($10^{-1}$ s.d. $10^{-5}$): 2 - 1 - 0 - 0 - 0
- Cara memilih: Ambil tiga seri pengenceran pertama.
- Kombinasi terpilih: 2 - 1 - 0 (mewakili seri $10^{-1}, 10^{-2}, 10^{-3}$).
Aturan 3 (Tabung positif di pengenceran tinggi): Jika masih terdapat hasil positif setelah 3 seri yang dipilih, jumlahkan nilai positif tersebut ke digit ketiga.
- Hasil pengamatan ($10^{-1}$ s.d. $10^{-5}$): 3 - 2 - 0 - 1 - 0
- Cara memilih: Tiga seri utama yang dipilih berdasarkan Aturan 1 adalah 3 - 2 - 0 ($10^{-1}, 10^{-2}, 10^{-3}$). Karena terdapat angka 1 pada pengenceran $10^{-4}$, tambahkan angka tersebut ke digit ketiga ($0 + 1 = 1$).
- Kombinasi terpilih: 3 - 2 - 1 (tetap mewakili seri $10^{-1}, 10^{-2}, 10^{-3}$).

4. Rumus Konversi Faktor Pengenceran

Karena tabel standar di atas dikalibrasi untuk seri $10^{-1}, 10^{-2}, 10^{-3}$ (di mana tabung tengah memiliki inokulum $0.01\text{ g/mL}$), penggunaan seri pengenceran yang lebih tinggi mengharuskan Anda mengalikan nilai Indeks MPN dari tabel dengan Faktor Koreksi Pengenceran:

$$\text{MPN/g atau mL} = \text{Indeks MPN Tabel} \times \frac{0.01}{V_{\text{tengah}}}$$

Atau dalam bentuk ekuivalen yang sering digunakan di laboratorium:

$$\text{MPN/g atau mL} = \text{Indeks MPN Tabel} \times \frac{10}{\text{Faktor Pengenceran Tabung Pertama yang Dipilih}}$$

Keterangan:

$V_{\text{tengah}}$ = Massa atau volume sampel asli ($\text{g}$ atau $\text{mL}$) pada tabung seri tengah dari 3 kombinasi yang dipilih (misal: untuk seri $10^{-2}, 10^{-3}, 10^{-4}$, maka $V_{\text{tengah}} = 10^{-3} = 0.001\text{ g}$).

5. Contoh Perhitungan Lengkap

Kasus	Hasil Pengamatan ($10^{-1}$ : $10^{-2}$ : $10^{-3}$ : $10^{-4}$ : $10^{-5}$)	Seri Terpilih	Kode MPN	Indeks Tabel	$V_{\text{tengah}}$ ($\text{g}$)	Perhitungan Akhir ($\text{MPN/g}$)
Sampel A	`3 - 3 - 2 - 1 - 0`	$10^{-2}, 10^{-3}, 10^{-4}$	3 - 2 - 1	$15.0$	$0.001$	$15.0 \times \frac{0.01}{0.001} = \mathbf{150\text{ MPN/g}}$
Sampel B	`3 - 3 - 3 - 1 - 0`	$10^{-3}, 10^{-4}, 10^{-5}$	3 - 1 - 0	$4.3$	$0.0001$	$4.3 \times \frac{0.01}{0.0001} = \mathbf{430\text{ MPN/g}}$
Sampel C	`2 - 0 - 0 - 0 - 0`	$10^{-1}, 10^{-2}, 10^{-3}$	2 - 0 - 0	$0.9$	$0.01$	$0.9 \times \frac{0.01}{0.01} = \mathbf{0.9\text{ MPN/g}}$

Referensi

Blodgett, R. (2020). BAM Appendix 2: Most Probable Number from Serial Dilutions. U.S. Food and Drug Administration (FDA) Bacteriological Analytical Manual.

Panduan Protokol Kombinasi MPN-PCR untuk Deteksi dan Kuantifikasi Bakteri Patogen Pada Sayuran Hijau

Tue, 26 May 2026 10:00:00 +0000

PROTOKOL PENELITIAN (Contoh)

Deteksi dan Kuantifikasi Staphylococcus aureus pada Kubis (Brassica oleracea) Menggunakan Integrasi Most Probable Number (MPN) dan Polymerase Chain Reaction (PCR)

Dibuat Oleh: Dr. Nodali Ndraha
Versi: 1.0.1 (Revisi Satuan Mikro)
Tanggal: 27 Mei 2026

1. PENDAHULUAN & PRINSIP METODE

Kontaminasi bakteri patogen pada sayuran hijau, khususnya kubis, merupakan ancaman serius bagi keamanan pangan karena sering dikonsumsi mentah (sebagai lalapan). Staphylococcus aureus adalah patogen oportunistik yang mampu menghasilkan enterotoksin tahan panas.

Metode konvensional MPN mengandalkan konfirmasi biokimia yang memakan waktu hingga 5-7 hari. Protokol hibrida MPN-PCR ini menggabungkan kapasitas kuantifikasi dari metode MPN (3-seri tabung) dengan spesifisitas tinggi serta kecepatan dari amplifikasi DNA (PCR) untuk mendeteksi gen femA — sebuah penanda genetik spesifik untuk S. aureus yang meregulasi pembentukan jembatan peptidoglikan dinding sel.

2. ALAT DAN BAHAN

A. Peralatan Utama

Stomacher (Homogenizer laboratorium) beserta kantong steril (stomacher bags).
Thermal Cycler (Mesin PCR).
Aparatus Elektroforesis Gel Horizontal beserta Power Supply.
Gel Documentation System (UV Transilluminator / Blue Light LED).
Inkubator (Akurasi suhu 35°C ± 1°C).
Mikropipet (Rentang volume 0.5–10 µL, 10–100 µL, dan 100–1000 µL) beserta filter tips steril.
Sentrifugasi Mikro (Microcentrifuge dengan kecepatan hingga 13.000 rpm).
Water Bath / Heating Block digital.

B. Media dan Reagen Kimia

Buffered Peptone Water (BPW) 1% (sebagai media pra-pengayaan dan pengencer).
Giaconetti / Giolitti-Cantoni Broth atau Tryptic Soy Broth (TSB) + 10% NaCl (sebagai media selektif MPN untuk S. aureus).
Nuclease-Free Water (NFW).
PCR Master Mix 2X (mengandung Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, dan buffer reaksi).
Primer Spesifik untuk Gen femA:
- FemA-F: 5’-AAAAAAGCACATAACAAAGC-3’
- FemA-R: 5’-GATAAAGAAGAAACCAGCAG-3’
- Target Amplikon: 132 bp.
Larutan NaOH 0.5 M (jika menggunakan metode ekstraksi NaOH).
Agarosa (derajat biologi molekuler).
Buffer TAE 1X atau TBE 1X.
DNA Stain (seperti GelRed, Ethidium Bromide, atau SYBR Safe).
DNA Ladder 100 bp.

3. TAHAPAN PROTOKOL KERJA

[Alur Kerja Protokol]
Sampling Kubis -> Transportasi Dingin (<4°C) -> Homogenisasi (10g dalam 90ml BPW)
 |
 v
Serial Dilution (10^-1, 10^-2, 10^-3) -> Inokulasi ke 3-Tabung MPN -> Inkubasi 24 Jam
 |
 v
Ekstraksi DNA (Metode Boiling/NaOH) -> Amplifikasi PCR (Gen femA)
 |
 v
Elektroforesis Gel Agarosa 2% -> Identifikasi Band (132 bp)
 |
 v
Kombinasi Kode Positif -> Cocokkan Tabel MPN -> Konversi ke MPN/g

Langkah 1: Pengumpulan dan Transportasi Sampel

Ambil sampel kubis segar secara aseptik minimal 200-500 gram menggunakan sarung tangan steril dan masukkan ke dalam kantong sampel steril.
Tempatkan sampel di dalam cool box yang dilengkapi dengan ice pack untuk menjaga suhu transportasi tetap berada pada < 4°C.
Transportasikan sampel ke laboratorium segera. Proses analisis wajib dimulai dalam rentang waktu maksimal 24 jam setelah pengambilan sampel untuk mencegah perubahan mikroflora alami.

Langkah 2: Homogenisasi dan Pengenceran Berseri (Serial Dilution)

Timbang 10 gram sampel kubis secara aseptik (potong kecil-kecil menggunakan pisau/gunting steril jika diperlukan).
Masukkan sampel ke dalam stomacher bag, lalu tambahkan 90 mL media BPW 1% hangat (perbandingan 1:10).
Homogenkan menggunakan alat stomacher selama 2 menit dengan kecepatan normal. Campuran ini dikategorikan sebagai Pengenceran 10⁻¹.
Lakukan pengenceran berseri secara logaritmik:
- Ambil 1 mL dari pengenceran 10⁻¹, masukkan ke dalam tabung berisi 9 mL BPW steril (Pengenceran 10⁻²).
- Ambil 1 mL dari pengenceran 10⁻², masukkan ke dalam tabung berisi 9 mL BPW steril (Pengenceran 10⁻³).
- Lakukan terus hingga tingkat pengenceran yang diperkirakan sesuai dengan tingkat kontaminasi target.

Langkah 3: Inokulasi dan Inkubasi Seri 3-Tabung MPN

Siapkan 3 set tabung reaksi (masing-masing set berisi 3 tabung, total 9 tabung) yang telah diisi dengan 9 mL media selektif (TSB + 10% NaCl atau Giolitti-Cantoni Broth).
Set I (Pengenceran 10⁻¹): Inokulasikan 1 mL suspensi pengenceran 10⁻¹ ke dalam masing-masing dari 3 tabung pertama.
Set II (Pengenceran 10⁻²): Inokulasikan 1 mL suspensi pengenceran 10⁻² ke dalam masing-masing dari 3 tabung kedua.
Set III (Pengenceran 10⁻³): Inokulasikan 1 mL suspensi pengenceran 10⁻³ ke dalam masing-masing dari 3 tabung ketiga.
Homogenkan seluruh tabung secara perlahan menggunakan vortex.
Inkubasi seluruh tabung pada suhu 35°C ± 1°C selama 24 jam di bawah kondisi aerobik.

Langkah 4: Skrining Visual dan Ekstraksi DNA Templat

Setelah 24 jam, amati kekeruhan (turbidity) atau perubahan warna pada tabung MPN. Seluruh tabung yang menunjukkan indikasi pertumbuhan bakteri (keruh) akan diproses untuk ekstraksi DNA.

Catatan: Jika ragu, ambil seluruh tabung untuk meminimalkan hasil negatif palsu (false-negative).

Opsi A: Metode Pemasakan (Boiling Method - Direkomendasikan untuk Efisiensi Waktu)

Ambil 1 mL kultur dari tabung MPN yang positif, masukkan ke dalam mikrotabung 1.5 mL.
Sentrifugasi pada 12.000 rpm selama 5 menit untuk mengendapkan pelet sel. Buang supernatannya.
Cuci pelet dengan menambahkan 500 µL Sterile Aquabidest/NFW, sentrifugasi kembali, dan buang supernatannya.
Resuspensi pelet dalam 100 µL NFW.
Panaskan mikrotabung dalam heating block pada suhu 95°C - 100°C selama 10–15 menit untuk melisiskan dinding sel S. aureus.
Dinginkan segera di atas es (ice bath) selama 5 menit.
Sentrifugasi pada 13.000 rpm selama 3 menit. Ambil bagian supernatant yang mengandung DNA kasar (crude DNA) dan pindahkan ke tabung baru. Simpan pada suhu -20°C sebagai templat PCR.

Opsi B: Metode NaOH Lisis Ringan

Ambil 1 mL kultur, sentrifugasi pelet seperti di atas.
Resuspensi pelet sel dalam 50 µL larutan NaOH 0.5 M.
Inkubasi pada suhu ruang selama 5 menit, lalu panaskan pada suhu 95°C selama 5 menit.
Tambahkan 50 µL Buffer Tris-HCl (pH 8.0) untuk menetralkan pH larutan.
Sentrifugasi pada 12.000 rpm selama 5 menit, ambil supernatannya.

Opsi C: Komersial Kit (DNeasy Blood & Tissue Kit / Sejenis)

Ikuti protokol isolasi bakteri Gram-Positif dari manufaktur, yang melibatkan penambahan enzim Lisozim atau Lisostafin (wajib untuk lisis dinding sel peptidoglikan tebal milik S. aureus).

Langkah 5: Amplifikasi PCR (Target Gen femA)

Siapkan campuran reaksi PCR dalam tabung PCR 0.2 mL steril secara aseptik di dalam PCR Hood.

Komposisi Reaksi PCR (Volume Total: 25 µL)

Komponen Reaksi	Konsentrasi Awal	Volume per Reaksi (µL)	Konsentrasi Akhir
PCR Master Mix 2X	2X	12.5 µL	1X
Primer Forward (FemA-F)	10 µM	1.0 µL	0.4 µM
Primer Reverse (FemA-R)	10 µM	1.0 µL	0.4 µM
DNA Templat	bervariasi	2.0 µL	~10–50 ng
Nuclease-Free Water (NFW)	-	8.5 µL	Ad 25 µL

Pengaturan Profil Siklus Termal (Siklus PCR)

Tahapan Reaksi	Suhu	Durasi Waktu	Jumlah Siklus
Denaturasi Awal	94°C	5 menit	1 siklus
Denaturasi	94°C	30 detik
Annealing (Pempelotan)	55°C	30 detik	35 siklus
Ekstensi / Elongasi	72°C	45 detik
Ekstensi Akhir	72°C	5 menit	1 siklus
*Penyimpanan (Holding)*	4°C	$\infty$	-

Langkah 6: Separasi dengan Elektroforesis Gel Agarosa

Pembuatan Gel: Timbang 2.0 gram agarosa dalam 100 mL Buffer TAE 1X atau TBE 1X (konsentrasi 2% w/v untuk pemisahan fragmen kecil ~100 bp). Larutkan dengan microwave hingga jernih.
Dinginkan hingga larutan suam-suam kuku (≈ 50°C), tambahkan 5 µL DNA Stain (misal: GelRed). Tuang ke dalam cetakan gel yang telah dipasang sisir sumuran.
Setelah gel memadat, masukkan gel ke dalam bak elektroforesis yang telah diisi buffer TAE/TBE 1X.
Masukkan 5 µL produk PCR ke dalam sumuran gel. Jangan lupa masukkan 3 µL DNA Ladder 100 bp pada sumuran pertama sebagai marker ukuran.
Jalankan elektroforesis pada tegangan 100 Volt selama 40–45 menit.
Visualisasikan pita DNA menggunakan Gel Documentation System.

4. IDENTIFIKASI, INTERPRETASI DATA, DAN KUANTIFIKASI

A. Identifikasi Molekuler

Hasil Positif S. aureus: Jika visualisasi gel menunjukkan pita DNA (band) yang tegas migrasinya sejajar dengan ukuran 132 bp pada DNA Ladder.
Kontrol Negatif: Tidak boleh memunculkan pita apa pun (jika ada pita, terjadi kontaminasi sistemik).
Kontrol Positif: Wajib menunjukkan pita tegas pada 132 bp menggunakan DNA kontrol dari strain murni S. aureus (misal ATCC 25923).

B. Kuantifikasi Menggunakan Kode MPN 3-Tabung

Catat jumlah tabung yang terkonfirmasi positif PCR (memiliki pita 132 bp) pada masing-masing seri pengenceran. Kombinasi 3 digit angka yang diperoleh (misal: 3-2-1) dikonversikan menggunakan Tabel Standar MPN 3-Tabung untuk mendapatkan indeks nilai MPN per gram sampel.

Tabel Referensi MPN 3-Tabung (Contoh Selektif Nilai Umum)

Tabung Positif (10⁻¹)	Tabung Positif (10⁻²)	Tabung Positif (10⁻³)	Indeks MPN (per gram)	Batas Kepercayaan 95% Rendah	Batas Kepercayaan 95% Tinggi
0	0	0	< 0.3	0.0	0.95
1	0	0	0.36	0.02	1.7
2	0	0	0.92	0.15	3.5
3	0	0	2.3	0.46	9.4
3	1	0	4.3	0.9	18.1
3	2	1	15.0	3.0	48.0
3	3	2	110.0	30.0	380.0
3	3	3	> 110.0	-	-

Rumus Kalibrasi/Koreksi Faktor Pengenceran

Jika tingkat pengenceran awal yang diinokulasikan berbeda dari deretan seri standar dasar (10⁻¹, 10⁻², 10⁻³), gunakan rumus kalibrasi berikut:

Hasil Akhir (MPN/g) = Nilai Indeks MPN dari Tabel × (0.1 / Volume pengenceran terendah yang digunakan)

Contoh Kasus: Bila kombinasi tabung positif berdasarkan konfirmasi PCR femA menunjukkan angka 3-2-1, maka nilai indeks tabel adalah 15.0. Jika deretan pengenceran yang dimasukkan ke tabung adalah benar bermula dari 10⁻¹ (setara 0.1 g/mL sampel), maka densitas bakteri target adalah 15.0 MPN/g.

5. CATATAN KESELAMATAN & JAMINAN MUTU (QA/QC)

S. aureus adalah patogen Biosafety Level 2 (BSL-2). Seluruh pengerjaan kultur wajib dilakukan di dalam Biosafety Cabinet (BSC) Kelas II.
Gunakan area terpisah untuk: (A) Preparasi Master Mix PCR, (B) Isolasi DNA Templat, dan (C) Elektroforesis produk pasca-PCR untuk mencegah kontaminasi silang bawaan (carry-over contamination).
Autoklaf seluruh limbah kultur MPN pada suhu 121°C selama 15 menit sebelum dibuang ke sistem pembuangan biomedis.