PROTOKOL PENELITIAN (Contoh)

Deteksi dan Kuantifikasi Staphylococcus aureus pada Kubis (Brassica oleracea) Menggunakan Integrasi Most Probable Number (MPN) dan Polymerase Chain Reaction (PCR)

Dibuat Oleh: Laboratorium Mikrobiologi dan Keamanan Pangan Nasional
Versi: 1.0.1 (Revisi Satuan Mikro)
Tanggal: 27 Mei 2026

1. PENDAHULUAN & PRINSIP METODE

Kontaminasi bakteri patogen pada sayuran hijau, khususnya kubis, merupakan ancaman serius bagi keamanan pangan karena sering dikonsumsi mentah (sebagai lalapan). Staphylococcus aureus adalah patogen oportunistik yang mampu menghasilkan enterotoksin tahan panas.

Metode konvensional MPN mengandalkan konfirmasi biokimia yang memakan waktu hingga 5-7 hari. Protokol hibrida MPN-PCR ini menggabungkan kapasitas kuantifikasi dari metode MPN (3-seri tabung) dengan spesifisitas tinggi serta kecepatan dari amplifikasi DNA (PCR) untuk mendeteksi gen femA — sebuah penanda genetik spesifik untuk S. aureus yang meregulasi pembentukan jembatan peptidoglikan dinding sel.

2. ALAT DAN BAHAN

A. Peralatan Utama

1. Stomacher (Homogenizer laboratorium) beserta kantong steril (stomacher bags).
2. Thermal Cycler (Mesin PCR).
3. Aparatus Elektroforesis Gel Horizontal beserta Power Supply.
4. Gel Documentation System (UV Transilluminator / Blue Light LED).
5. Inkubator (Akurasi suhu 35°C ± 1°C).
6. Mikropipet (Rentang volume 0.5–10 µL, 10–100 µL, dan 100–1000 µL) beserta filter tips steril.
7. Sentrifugasi Mikro (Microcentrifuge dengan kecepatan hingga 13.000 rpm).
8. Water Bath / Heating Block digital.

B. Media dan Reagen Kimia

1. Buffered Peptone Water (BPW) 1% (sebagai media pra-pengayaan dan pengencer).
2. Giaconetti / Giolitti-Cantoni Broth atau Tryptic Soy Broth (TSB) + 10% NaCl (sebagai media selektif MPN untuk S. aureus).
3. Nuclease-Free Water (NFW).
4. PCR Master Mix 2X (mengandung Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂, dan buffer reaksi).
5. Primer Spesifik untuk Gen femA:
   • FemA-F: 5’-AAAAAAGCACATAACAAAGC-3’
   • FemA-R: 5’-GATAAAGAAGAAACCAGCAG-3’
   • Target Amplikon: 132 bp.
6. Larutan NaOH 0.5 M (jika menggunakan metode ekstraksi NaOH).
7. Agarosa (derajat biologi molekuler).
8. Buffer TAE 1X atau TBE 1X.
9. DNA Stain (seperti GelRed, Ethidium Bromide, atau SYBR Safe).
10. DNA Ladder 100 bp.

3. TAHAPAN PROTOKOL KERJA

[Alur Kerja Protokol]
Sampling Kubis -> Transportasi Dingin (<4°C) -> Homogenisasi (10g dalam 90ml BPW)
       |
       v
Serial Dilution (10^-1, 10^-2, 10^-3) -> Inokulasi ke 3-Tabung MPN -> Inkubasi 24 Jam
       |
       v
Ekstraksi DNA (Metode Boiling/NaOH) -> Amplifikasi PCR (Gen femA)
       |
       v
Elektroforesis Gel Agarosa 2% -> Identifikasi Band (132 bp)
       |
       v
Kombinasi Kode Positif -> Cocokkan Tabel MPN -> Konversi ke MPN/g

Langkah 1: Pengumpulan dan Transportasi Sampel

1. Ambil sampel kubis segar secara aseptik minimal 200-500 gram menggunakan sarung tangan steril dan masukkan ke dalam kantong sampel steril.
2. Tempatkan sampel di dalam cool box yang dilengkapi dengan ice pack untuk menjaga suhu transportasi tetap berada pada < 4°C.
3. Transportasikan sampel ke laboratorium segera. Proses analisis wajib dimulai dalam rentang waktu maksimal 24 jam setelah pengambilan sampel untuk mencegah perubahan mikroflora alami.

Langkah 2: Homogenisasi dan Pengenceran Berseri (Serial Dilution)

1. Timbang 10 gram sampel kubis secara aseptik (potong kecil-kecil menggunakan pisau/gunting steril jika diperlukan).
2. Masukkan sampel ke dalam stomacher bag, lalu tambahkan 90 mL media BPW 1% hangat (perbandingan 1:10).
3. Homogenkan menggunakan alat stomacher selama 2 menit dengan kecepatan normal. Campuran ini dikategorikan sebagai Pengenceran 10⁻¹.
4. Lakukan pengenceran berseri secara logaritmik:
   • Ambil 1 mL dari pengenceran 10⁻¹, masukkan ke dalam tabung berisi 9 mL BPW steril (Pengenceran 10⁻²).
   • Ambil 1 mL dari pengenceran 10⁻², masukkan ke dalam tabung berisi 9 mL BPW steril (Pengenceran 10⁻³).
   • Lakukan terus hingga tingkat pengenceran yang diperkirakan sesuai dengan tingkat kontaminasi target.

Langkah 3: Inokulasi dan Inkubasi Seri 3-Tabung MPN

1. Siapkan 3 set tabung reaksi (masing-masing set berisi 3 tabung, total 9 tabung) yang telah diisi dengan 9 mL media selektif (TSB + 10% NaCl atau Giolitti-Cantoni Broth).
2. Set I (Pengenceran 10⁻¹): Inokulasikan 1 mL suspensi pengenceran 10⁻¹ ke dalam masing-masing dari 3 tabung pertama.
3. Set II (Pengenceran 10⁻²): Inokulasikan 1 mL suspensi pengenceran 10⁻² ke dalam masing-masing dari 3 tabung kedua.
4. Set III (Pengenceran 10⁻³): Inokulasikan 1 mL suspensi pengenceran 10⁻³ ke dalam masing-masing dari 3 tabung ketiga.
5. Homogenkan seluruh tabung secara perlahan menggunakan vortex.
6. Inkubasi seluruh tabung pada suhu 35°C ± 1°C selama 24 jam di bawah kondisi aerobik.

Langkah 4: Skrining Visual dan Ekstraksi DNA Templat

Setelah 24 jam, amati kekeruhan (turbidity) atau perubahan warna pada tabung MPN. Seluruh tabung yang menunjukkan indikasi pertumbuhan bakteri (keruh) akan diproses untuk ekstraksi DNA.

Catatan: Jika ragu, ambil seluruh tabung untuk meminimalkan hasil negatif palsu (false-negative).

Opsi A: Metode Pemasakan (Boiling Method - Direkomendasikan untuk Efisiensi Waktu)

1. Ambil 1 mL kultur dari tabung MPN yang positif, masukkan ke dalam mikrotabung 1.5 mL.
2. Sentrifugasi pada 12.000 rpm selama 5 menit untuk mengendapkan pelet sel. Buang supernatannya.
3. Cuci pelet dengan menambahkan 500 µL Sterile Aquabidest/NFW, sentrifugasi kembali, dan buang supernatannya.
4. Resuspensi pelet dalam 100 µL NFW.
5. Panaskan mikrotabung dalam heating block pada suhu 95°C - 100°C selama 10–15 menit untuk melisiskan dinding sel S. aureus.
6. Dinginkan segera di atas es (ice bath) selama 5 menit.
7. Sentrifugasi pada 13.000 rpm selama 3 menit. Ambil bagian supernatant yang mengandung DNA kasar (crude DNA) dan pindahkan ke tabung baru. Simpan pada suhu -20°C sebagai templat PCR.

Opsi B: Metode NaOH Lisis Ringan

1. Ambil 1 mL kultur, sentrifugasi pelet seperti di atas.
2. Resuspensi pelet sel dalam 50 µL larutan NaOH 0.5 M.
3. Inkubasi pada suhu ruang selama 5 menit, lalu panaskan pada suhu 95°C selama 5 menit.
4. Tambahkan 50 µL Buffer Tris-HCl (pH 8.0) untuk menetralkan pH larutan.
5. Sentrifugasi pada 12.000 rpm selama 5 menit, ambil supernatannya.

Opsi C: Komersial Kit (DNeasy Blood & Tissue Kit / Sejenis)

• Ikuti protokol isolasi bakteri Gram-Positif dari manufaktur, yang melibatkan penambahan enzim Lisozim atau Lisostafin (wajib untuk lisis dinding sel peptidoglikan tebal milik S. aureus).

Langkah 5: Amplifikasi PCR (Target Gen femA)

Siapkan campuran reaksi PCR dalam tabung PCR 0.2 mL steril secara aseptik di dalam PCR Hood.

Komposisi Reaksi PCR (Volume Total: 25 µL)

Pengaturan Profil Siklus Termal (Siklus PCR)

Langkah 6: Separasi dengan Elektroforesis Gel Agarosa

1. Pembuatan Gel: Timbang 2.0 gram agarosa dalam 100 mL Buffer TAE 1X atau TBE 1X (konsentrasi 2% w/v untuk pemisahan fragmen kecil ~100 bp). Larutkan dengan microwave hingga jernih.
2. Dinginkan hingga larutan suam-suam kuku (≈ 50°C), tambahkan 5 µL DNA Stain (misal: GelRed). Tuang ke dalam cetakan gel yang telah dipasang sisir sumuran.
3. Setelah gel memadat, masukkan gel ke dalam bak elektroforesis yang telah diisi buffer TAE/TBE 1X.
4. Masukkan 5 µL produk PCR ke dalam sumuran gel. Jangan lupa masukkan 3 µL DNA Ladder 100 bp pada sumuran pertama sebagai marker ukuran.
5. Jalankan elektroforesis pada tegangan 100 Volt selama 40–45 menit.
6. Visualisasikan pita DNA menggunakan Gel Documentation System.

4. IDENTIFIKASI, INTERPRETASI DATA, DAN KUANTIFIKASI

A. Identifikasi Molekuler

• Hasil Positif S. aureus: Jika visualisasi gel menunjukkan pita DNA (band) yang tegas migrasinya sejajar dengan ukuran 132 bp pada DNA Ladder.
• Kontrol Negatif: Tidak boleh memunculkan pita apa pun (jika ada pita, terjadi kontaminasi sistemik).
• Kontrol Positif: Wajib menunjukkan pita tegas pada 132 bp menggunakan DNA kontrol dari strain murni S. aureus (misal ATCC 25923).

B. Kuantifikasi Menggunakan Kode MPN 3-Tabung

Catat jumlah tabung yang terkonfirmasi positif PCR (memiliki pita 132 bp) pada masing-masing seri pengenceran. Kombinasi 3 digit angka yang diperoleh (misal: 3-2-1) dikonversikan menggunakan Tabel Standar MPN 3-Tabung untuk mendapatkan indeks nilai MPN per gram sampel.

Tabel Referensi MPN 3-Tabung (Contoh Selektif Nilai Umum)

Rumus Kalibrasi/Koreksi Faktor Pengenceran

Jika tingkat pengenceran awal yang diinokulasikan berbeda dari deretan seri standar dasar (10⁻¹, 10⁻², 10⁻³), gunakan rumus kalibrasi berikut:

Hasil Akhir (MPN/g) = Nilai Indeks MPN dari Tabel × (0.1 / Volume pengenceran terendah yang digunakan)

Contoh Kasus: Bila kombinasi tabung positif berdasarkan konfirmasi PCR femA menunjukkan angka 3-2-1, maka nilai indeks tabel adalah 15.0. Jika deretan pengenceran yang dimasukkan ke tabung adalah benar bermula dari 10⁻¹ (setara 0.1 g/mL sampel), maka densitas bakteri target adalah 15.0 MPN/g.

5. CATATAN KESELAMATAN & JAMINAN MUTU (QA/QC)

1. S. aureus adalah patogen Biosafety Level 2 (BSL-2). Seluruh pengerjaan kultur wajib dilakukan di dalam Biosafety Cabinet (BSC) Kelas II.
2. Gunakan area terpisah untuk: (A) Preparasi Master Mix PCR, (B) Isolasi DNA Templat, dan (C) Elektroforesis produk pasca-PCR untuk mencegah kontaminasi silang bawaan (carry-over contamination).
3. Autoklaf seluruh limbah kultur MPN pada suhu 121°C selama 15 menit sebelum dibuang ke sistem pembuangan biomedis.